(反相色谱方法开发流程)

反相高效液相色谱法RPHPLC使用亲水性的固定相和疏水性的移动相，利用样品分子在移动相和固定相之间的互作用力差异进行分离一基本原理1疏水性固定相反相色谱柱通常使用疏水性的固定相材料，如疏水链状碳氢化合物改性的硅胶或封闭的C18链，使分析物在移动相中具有亲水性，与固定相表面发生疏水作；解决方案是加强保留，若不改变固定相，可向流动相中加入添加剂抑制被测物电离，最极端的就是离子对色谱或更换色谱柱，使用HILIC模式可耐纯水相的色谱柱反相与离子交换的混合填料等具体还是要看目标物结构其实反相分离还是可以解决很多问题的注意流动相pH和样品的溶液都要使目标物呈游离态，有；在酸性流动相条件下提供良好的稳定性和重现性因此，StableBond色谱柱成为低pH值方法开发的首选在方法开发初期，若选定流动相为酸性，可将此类色谱柱作为首选选择性高灵敏度高分析速度快C18反相色谱有明显的优势，它可直接进样分析水溶性样品，因而适用范围广，被誉为“标准固定相分离模式“；在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相它是将全多孔或薄壳微粒硅胶载体，经酸活化处理后与含轻基链c4C8C18或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等关于反相色谱的分离机理，吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上；根据固定相和流动相的成分不同，HPLC可以分为正相色谱和反相色谱正相色谱使用极性固定相，如聚乙二醇或氨基与腈基键合相，流动相则为相对非极性的疏水性溶剂，如烷烃类反相色谱则使用非极性固定相，如C18或C8，流动相通常是水或缓冲液，加入有机溶剂如甲醇乙腈等来调节保留时间反相色谱在现代；高效液相色谱法包括正相高效液相色谱法和反相高效液相色谱法 正相高效液相色谱法中流动相的极性小于固定相的极性，也就是以及性键合相为固定相常以氨基氰基键合相等作为固定相反相高效液相色谱法中流动相的极性大于固定相的极性，也就是以非极性键合相为固定常以十八硅烷C18辛烷C8甲基C1；首先，根据物质的紫外吸收确定波长比如A物质扫描全波长紫外图谱，确定它在254nm波长下有最大吸收，另外有末端吸收，那么波长就可以选择254nm或者210nm其次，根据物质的极性选择色谱柱和流动相比例比如极性很小的物质，就可以把流动相中的有机相比例增大另外的一些要根据物质的特性来选择，比如色谱峰。

流动相极性与固定液极性应具有较大差别，以减少固定液流失固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法，固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法尽管目前键合相色谱柱已成为主流，但这一概念在色谱方法开发预测出峰顺序等方面具有重要意义；高效液相色谱的正相与反相区分方式如下正相色谱固定相极性大于流动相极性反相色谱固定相极性小于流动相极性高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分离度液相色谱”“近代柱色谱”等高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体；在制备样品时，需要注意样品的保存条件，以避免溶剂挥发或样品变质2 离子强度调整反相高效液相色谱法中，样品溶液的离子强度会影响柱效和分离效果因此，在测定茶叶中咖啡时，需注意调整样品溶液的离子强度，通常可以通过添加适当的缓冲溶液或离子对进行调整3 色谱柱选择选择合适的反相色谱柱以实现；液相色谱中固定相极性小于流动相极性的色谱方法称为反相色谱法反相色谱法英语Reversedphase chromatography，RPC反相色谱法IGC一反普通气相色谱的测定方式以被测的高分子为固定相以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子将探针分子注入气化室。

反相色谱柱的种类繁多C18苯基HILIC和离子交换，根据目标化合物的耐受性，挑选适合的品牌和特性是成功分离的保障lt固定相的孔径长度和粒径的选择，要兼顾压力和柱效，通常为35μm，方法开发时，封端C18柱调整pH，通过等度或梯度洗脱策略来分离目标化合物lt等度洗脱，逐步降低有机相比例；使不同物质得到分离流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱非极性键合相色谱可作反相色谱在现代液相色谱中应用最广泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的反相介质性能稳定分离效率高，可分离蛋白质肽氨基酸核酸等含有非极性基团的各种物质。

高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC又叫做高压或高速液相色谱高分离度液相色谱或近代柱色谱，以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支它是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样。

正相色谱法当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析反相色谱法当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法HPLC其基本方法是用高压泵将具有一定极性的；中等极性物质在反相色谱中可能需要更复杂的优化和分离条件以下是一些可能的方法柱填料选择考虑使用介于弱极性和强极性之间的柱填料，如C8柱流动相的优化考虑梯度洗脱或者使用添加剂如盐类来调节极性，提高分离效果样品预处理如果可能，可以尝试使用前处理方法，如萃取或者洗脱，来提高中等；反相键合相色谱法 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系固定相，常用十八烷基ODS或C键合相流动相常用甲醇水或乙腈水非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成1 分离机制 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代。